Fil-proċess tat-twettiq ta 'studji ġenetiċi, ħafna drabi niltaqgħu ma' kampjuni ta 'RNA insuffiċjenti, pereżempju, għall-istudju ta' tumuri orali anatomiċi ċkejkna, anke kampjuni ta 'ċellula waħda, u kampjuni ta' mutazzjonijiet speċifiċi tal-ġeni li huma traskritti f'livelli baxxi ħafna fiċ-ċelloli umani.Naturalment, għat-test tal-COVID-19, jekk it-tampuni ma jkunux fil-post it-tajjeb jew mhux biżżejjed ħinijiet waqt it-teħid tal-kampjuni, id-daqs tal-kampjun ikun baxx ħafna, u għalhekk il-Kummissjoni tas-Saħħa u l-Ippjanar tal-Familja ħarġet jumejn ilu u għadda mit-test, u jekk il-kampjun tal-aċidu nuklejku ma ħax sitt kampjuni, tista 'tirrapportah.
Is-sensittività tar-reaġent hija importanti għaliex għandna din il-problema jew dik il-problema, allura x'nistgħu nagħmlu biex intejbu s-sensittività ta 'RT-PCR?
Qabel ma niddiskutu soluzzjonijiet possibbli, ejja nsemmu żewġ kumplikazzjonijiet kbar mas-sitwazzjoni li għadna kif semmejna.
L-ewwelnett, aħna ninkwetaw dwar it-telf ta 'RNA meta jkollna biss ftit popolazzjonijiet ta' ċelluli fil-kampjun tagħna.Jekk jintużaw metodi tradizzjonali ta 'separazzjoni u tindif, bħal metodu ta' kolonna jew metodu ta 'preċipitazzjoni ta' aċidu nuklejku, hemm possibbiltà kbira li l-ftit kampjuni jintilfu.Soluzzjoni waħda hija li żżid molekula trasportatur, bħal tRNA, iżda anke dakinhar, m'hemm l-ebda garanzija li l-esperiment ta 'rkupru tagħna huwa OK.
Allura x'inhu mod aħjar?Għażla tajba għal ċelloli kkultivati jew kampjuni mikroanatomiċi hija li tuża liżi diretta.
L-idea hija li taqsam iċ-ċelloli għal 5 minuti, tirrilaxxa l-RNA fis-soluzzjoni, imbagħad waqqaf ir-reazzjoni għal 2 minuti, imbagħad żid il-lisat direttament mar-reazzjoni ta 'traskrizzjoni inversa sabiex l-ebda RNA ma jintilef, u fl-aħħar poġġi l-cDNA li jirriżulta direttament fir-reazzjoni f'ħin reali.
Imma x'jiġri jekk, minħabba punt tat-tluq limitat jew ammont żgħir ta 'espressjoni tal-ġeni fil-mira, nistgħu nirriċiklaw l-RNA kollu u xorta ma nipprovdux mudelli biżżejjed biex niksbu sinjal tajjeb f'ħin reali?
F'dan il-każ, il-pass ta 'pre-amplifikazzjoni jista' jkun utli ħafna.
Din li ġejja hija skema biex tiżdied is-sensittività wara traskrizzjoni inversa.Qabel nibdew, irridu nistaqsu downstream liema miri aħna interessati fihom, sabiex infasslu primers speċifiċi għal dawn il-miri għall-pre-amplifikazzjoni.
Dan jista 'jinkiseb billi jinħoloq primer imħallat b'sa 100 par ta' primers u ċiklu ta 'reazzjoni ta' 10 sa 14-il darba.Għalhekk, Master Mix iddisinjat speċifikament għal dan ir-rekwiżit huwa meħtieġ biex jiġi amplifikat minn qabel is-cDNA miksub.
Ir-raġuni għall-iffissar tan-numru ta 'ċikli bejn 10 u 14 hija li dan in-numru limitat ta' ċikli jiżgura każwali bejn il-miri varji, li hija kruċjali għar-riċerkaturi li jeħtieġu informazzjoni molekulari kwantitattiva.
Wara l-amplifikazzjoni minn qabel, nistgħu niksbu ammont kbir ta 'cDNA, sabiex is-sensittività tal-kxif fil-back-end titjieb ħafna, u nistgħu saħansitra nħalltu l-kampjun u nwettqu reazzjonijiet PCR multipli f'ħin reali biex neliminaw żbalji każwali possibbli.
Ħin tal-post: Apr-11-2023